（文章篇）S5E08: 信号通路研究方法案例——看Nature文章的研究思路

在上篇文章：（策略篇）S5E07:信号通路研究策略三步骤中，我们总结了信号通路研究的四个层面和三个步骤：从效应到通路，从通路到分子，从分子到序列的分解策略，今天我们分享一篇Nature：AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade in transcriptional regulation of autophagy.Nature. 2016 Jun 15.（下载链接：http://pan.baidu.com/s/1eRTH8fo 密码：4uhk）。

首先看这文章的题目就很有感觉吧：AMPK-SKP2-CARM1 signalling cascade，大家在写文章和基金的时候可以学习这种高大上的描述方式哈，其它的说法还有：X/Y/Z Cascade，Axis，“Crosstalk”等等。

比如：Crosstalk 对话

比如： Axis信号轴

其实，看起来高大上的文章题目就是这么装B的……

好了，我们正式看这篇文章的机制和通路研究，首先我们把文章的几个关键分子理清楚，红色的是这个分子的分子功能：

CARM1：co-activator-associated arginine methyltransferase 1精氨酸甲基转移酶

SKP2：an F-box protein of the SCF E3 ubiquitin ligase complex E3泛素连接酶

AMPK：AMP-activated protein kinase 蛋白激酶

FOXO3a：forkhead family of transcription factors 转录因子

TFEB：transcription factor EB 转录因子

分子之间的关系是：葡萄糖饥饿——AMPK激活（发挥激酶作用）——FOXO3a磷酸化（发挥转录抑制作用）——SKP2转录抑制（发挥泛素化蛋白降解作用）—CARM1降解减少（发挥精氨酸甲基修饰作用）——转录激活TFEB（发挥转录激活作用）——自噬，不得不佩服作者在选择下游分子时的考量，牛B！

其实看明白文章的主线后，我们就可以整理成一下几个主题了；

1. 葡萄糖饥饿引起自噬，导致H3R17me2和CARM1上调。

个人认为：对于这篇Nature来说，这一步是最出彩，也是最关键的部分。作者说他们直接观察到H3R17me2修饰，然后发现精氨酸甲基化酶CARM1表达上调。话说一般人会直接检测组蛋白17位精氨酸的甲基化修饰吗？不会。所以我们怀疑：

a. 作者通过质谱进行葡萄糖饥饿处理组、对照组的甲基化修饰蛋白筛选，结果鉴定到这个位点，然后再找到CARM1；

b. 文章是反着做正着写的，即先通过SKP2找到的CARM1，然后再检测的精氨酸甲基化修饰；

c. 作者实验室就是研究组蛋白修饰的，而且对于组蛋白赖氨酸修饰已经研究的差不多了，所以研究下精氨酸修饰是很正常的。

至于具体哪个原因我们就不得而知了，这一步的因素变量是H3R17me2和CARM1，按照上次我们说的看文章的方法（（方法篇）：四步法快速读文章），具体内容就是针对这三个因素变量的加减法：

2. CARM1上调的原因是由于SKP2表达下调介导的泛素化降解被抑制。

从这一步开始，文章思路难度就开始降低了，如果我们如果遇到这种情况呢，就会考虑CARM1上调的水平是转录还是转录后，先测定下CARM1的mRNA和蛋白水平后再作判断，如果mRNA水平也有上调，那么考虑下甲基化修饰、转录激活因子、microRNA等等，这里作者没有说mRNA的变化，我们暂不考虑。接下来作者发现蛋白水平有变化了，一般我们也会考虑是翻译增加还是降解减少。好吧，作者再次直接看蛋白降解，我们一般是这么来做的：先做CARM1的IP+质谱，筛选下那些蛋白与CARM1结合的蛋白，然后再挑泛素连接酶，于是就出现了SKP2，那么这里的因素变量就是SKP2了：

3. SKP2表达下调的原因探索：从AMPK到FOXO3a的确定。

作者阐述这部分结果的时候，是从自噬——AMPK通路对SKP2的表达调控出发的，而FOXO3a的确定是这一步的关键。如果我们做到这一步，就会遇到这样的难题：已知SKP2的表达（mRNA和蛋白）下调，而自噬激活了AMPK信号通路，AMPK是个激酶，AMPK与SKP2两者之间是没有直接作用的。那么很自然的猜想就是：AMPK通过磷酸化某蛋白，激活这个蛋白，而这个蛋白正好能够下调SKP2 的表达，那么这个这个蛋白除了是转录因子（FOXO3a）外，还有没有其它可能呢？单纯从下调SKP2的表达下调来考虑，选择还是很多的。比如，作者就排除了蛋白水平降解的影响。

那么FOXO3a是怎么找到的呢? FOXO3a上游与AMPK的关系是通过文献报道，下游与SKP2的关系是通过信息学分析：SKP2有 FOXO3a的应答元件（FOXO response element，FRE）。再往下就是证明AMPK对 FOXO3a的磷酸化修饰和 FOXO3a对SKP2的转录抑制了。

4. 从CARM1到自噬效应通路探索：H3R17me2——TFEB——自噬相关通路

在确定CARM1下游通路中，作者用了我们熟悉的RNA-seq方法，并重点分析自噬相关基因，当然，也通过CHIP-seq来确定H3R17me2结合的基因启动子，再结合文献报道，从而把TFEB挑选出来。下面就是证明CARM1与TFEB的作用对下游基因和H3R17me2的影响了，这里的研究内容包括：CARM1与TFEB的结合，因素变量CARM1、TFEB和H3R17me2的干预对下游基因通路的影响。

最后我们简单回顾一下文章：作者研究的主题是细胞自噬，思路是先寻找到自噬相关的组蛋白甲基化修饰位点H3R17me2和CARM1，然后分别往CARM1的上游和下游扩展。上游看CARM1上调的原因，结果发现介导CARM1降解的泛素化连接酶SKP2表达下调；再往上走，发现SKP2下调的原因是转录抑制因子FOXO3a的激活；再往上走，最后发现FOXO3a的激活是由AMPK磷酸化介导，而AMPK通路在自噬过程中被激活是已经广为认可的了。下游：从CARM1上调后的结果出发，通过RNA测序、蛋白互作、CHIP、分子抑制剂等发现并验证了CARM1与TFEB对H3R17me2和自噬相关基因的调控作用。

选分子难，能做出来更难！

延伸相关阅读：

That’s all. Thank you!

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